Obiectiv 1: Determinarea caracteristicilor initiale ale nanovectorilor magnetici studiati

Intr-o prima etapa, au fost determinate caracteristicile morfo-structurale ale nanoparticulelor de oxid de fier (P904 produs de GUERBET Laboratories, Franta) utilizate in RMN ca agenti de contrast. P904 este un agent de contrast ce vizeaza detectia in RMN a celulelor macrophage implicate in bolile inflamatorii. Consta intr-un miez magnetic de oxid de fier (maghemita – γ-Fe2O3) ce are la suprafata un aminoalcool derivat al glucozei. Pentru determinarea caracteristicilor, s-au folosit diverse tehnici de microscopie electronica: a) microscopia electronica de baleiaj la presiune controlata – Wet-STEM; b) microscopia electronica de transmisie conventionala – CTEM; c) microscopia electronica de transmisie de inalta rezolutie – HRTEM; d) microscopia electronica de baleiaj in transmisie – STEM; e) spectroscopia de pierderi de energie a electronilor – EELS.

  Figura 1. Caracteristicile initiale ale agentului P904 studiate prin Wet STEM (a), CTEM (b), difractia de electroni (c) and HRTEM (d) cu Transformata Fourier (e) a imaginii HRTEM.

Comportamentul nanoparticulelor in lichid (mediul in care sunt injectate in pacienti) a fost determinat prin tehnica Wet STEM. Un exemplu de imagine Wet STEM a unei suspensii diluate (Figure 1a) confirma faptul ca nanoparticulele nu prezinta o tendinta puternica de aglomerare. Miezul de oxid de fier al nanoparticulelor apare ca un punct alb in imagine; o mare parte a nanoparticulelor din imagine prezinta o dimensiune intre 7 – 10 nm, ceea ce corespunde cu diametrul miezului raportat de GUERBET. In Figura 1 b - e sunt reproduse rezultatele studiului prin microscopie electronica a nanoparticulelor dupa depunerea si uscarea lor pe grila. Diagrama de difractie (c) realizata pe nanoparticulele din imaginea CTEM (b) evidentiaza structura de maghemita. Un exemplu de imagine HRTEM marita a unei nanoparticule (d) si transformata ei Fourier (e) confirma buna cristalizare a miezului.

Obiectiv 2.1: Studiul agentilor de contrast injectati in soareci sanatosi la diversi timpi prin tehnici de microscopie electronica

Scopul studiului a fost de a compara modul in care sunt preluate si transformate nanoparticulele de oxid de fier injectate in soareci sanatosi si soareci ApoE KO. Observatiile pe soarecii ApoE KO au fost realizate in timpul tezei de doctorat. Soarecii Apo E KO sunt modificati genetic (eliminata apolipoproteina E responsabila cu metabolismul lipidelor) astfel incat sa dezvolte mult mai rapid placa de ateroscleroza la un regim de hrana bogat in grasimi.

Soarecii normali au fost injectati cu agentul de contrast P904. Inainte si la diferite intervale de timp dupa injectare (1, 9, 15, 42, 66, 95, 127, 176, 238 si 283 zile), au fost prelevate esantioane de ficat si de splina, principalele organe de procesare si stocare a fierului in organism. Aceste esantioane au fost ulterior preparate prin fixare chimica pentru a fi observate in microscopul electronic. Dupa taiarea de sectiuni de 70 nm la ultramicrotom depuse pe grile de cupru, observatiile au fost facute la microscopul JEM ARM200F aflat la Institutul National CD pentru Fizica Materialelor.

Inainte de injectare (figura 2), se pot observa celule continut aglomerari de nanoparticule de feritina, amorfe conform diagramelor de difractie de electroni. Spectrele EELS realizate pe mai multe astfel de aglomerari demonstreaza ca raporturile atomice intre Oxigen si Fier sunt apropiate de cel corespunzator ferihidritei (Fe₅HO₈.4H₂0).

Figura 2. Aglomerari de nanoparticule de feritina in splina inainte de injectare.

In figura 3a, in imaginea CTEM, se observa ca nanoparticulele se gasesc aglomerate in vezicule si ca distributia lor in tesut este heterogena. Nanoparticulele sunt bine cristalizate (imaginea HRTEM – figura 3c) si, conform diagramei de difractie (figura 3b), pastreaza structura cristalina a maghemitei. Spectrul EELS (figura 3e) demonstreaza ca nanoparticulele au compozitia chimica apropiata maghemitei (54.91% at O, 45.09% at Fe). In timp, aceste nanoparticule sunt degradate datorita mediului acid prezent in vezicule (endozomi sau fagolizozomi), iar fierul eliberat in mediul celular este preluat si stocat sub forma de feritina. Feritina este o proteina cu rolul de stocare a fierului. Ea consta in 24 de sub-unitati de polipeptide Ft-H (MW≈21 kDa) si polipeptide Ft-L (MW≈19 kDa), precum si un miez de fier cu diametrul intre 2 – 7 nm.

Figura 3. Studiul nanoparticulelor in splina la 1 zi dupa injectare.

La 15 zile dupa injectarea agentului de contrast (figura 4), se pot observa vezicule ce contin atat nanoparticulele de maghemita, cat si nanoparticule de feritina. In regiunea 1, diagrama de difractie electronica indica prezenta nanoparticulelor cristalizate in structura maghemitei, aceasta fiind confirmata si de spectrul EELS unde raporturile atomice O:Fe sunt apropiate  de cele ale γ-Fe₂O₃. In regiunea 2, inele bine definite din diagrama de difractie demonstreaza existenta particulelor de P904, iar inelul difuz indica prezenta nanoparticulelor degradate.

Figura 4. Studiul nanoparticulelor in splina la 15 zile dupa injectare.

                 La 95 zile dupa injectarea agentului de contrast, se mai pot gasi celule (figura 5 - imagine CTEM) continand aglomerari de nanoparticulele inca bine cristalizate (figura 5c – imaginea HRTEM) avand structura maghemitei (figura 5b – diagrama de difractie). Spectrul EELS realizat pe o astfel de aglomerare confirma faptul ca nanoparticulele au o compozitie chimica apropiata maghemitei. In afara acestor aglomerari, se pot gasi in mediul intracelular nanoparticulele de feritina (figura 6 – imaginea CTEM). Spectrul EELS realizat pe cateva nanoparticule de feritina demonstreza ca acestea au o compozitie chimica (76.79% at O, 23.21% at Fe) corespunzatoare ferihidritei (Fe₅HO₈.4H₂0).

Figura 5. Nanoparticulele de maghemita prezente in splina la 95 zile dupa injectare.

Figura 6. Nanoparticule de feritina prezente in splina la 95 zile dupa injectarea agentului P904.

La 127 zile dupa administrarea intravenoasa, nanoparticulele de P904 nu au observate prin microscopia electronica de transmisie. In imaginile CTEM (7a-b), se pot observa doua aglomerari de dimensiuni diferite ce contin in majoritate nanoparticule de feritina, conform informatiilor obtinute din spectrele EELS. Folosind un fascicul nanometric in modul STEM, s-a realizat harta chimica a elementelor de interes (fier si oxigen) prezente pe o zona bine definita (dreptunghiul verde in figura 7c) dintr-o aglomerare de nanoparticule. Spectrele EELS realizate pe nanoparticulele prezente in acea zona demonstreaza existenta intr-un numar restrans a nanoparticulelor cu compozitia atomica apropiata de cea a maghemitei.

Figura 7. a-b) Aglomerari de feritina prezente in splina la 127 zile dupa injectarea agentului P904; c) harta O si Fe pe o zona dintr-o aglomerare de nanoparticule.

La o perioada mare de timp (238 zile) de la administrare, particulele de P904 au fost biotransformate integral in feritina (figura 8).

Figura 8. Nanoparticule de feritina prezente in splina la 238 zile dupa injectarea agentului P904.

Observatii similare cu cele prezentate mai sus in splina au fost facute si pe esantioanele de ficat. Nu au fost remarcate diferente fata de splina privind procesul de preluare si transformare a nanoparticulelor de oxid de fier in feritina.

Concluziile prezentate mai sus au fost confirmate si de masuratorile magnetice efectuate pe esantioanele de tesut de catre echipa condusa de Dr. Veronique Dupuis din cadrul Centrului de Magnetometrie a Universitatii Claude Bernard Lyon 1.

Masuratorile magnetice (figura 9a) au aratat ca semnalul naoparticulelor de P904 este dominant in primele trei luni de la injectarea lor in organism. Intre 95 si 120 zile de la injectare, pe masura ce agentul de contrast P904 este eliminat sau biotransformat, semnalul acestuia se diminueaza, curbele apropiindu-se de cea corespunzatoare soarecelui control.

Observand cu atentie curba la 120 zile (figura 9b), este evidenta aparitia unui pic la 9K si existenta unei componente duble cu un maxim spre 70K. Semnalul in prezenta unui camp magnetic slab (FC) se separa de semnalul obtinut in absenta campului magnetic (ZFC) spre aceasta temperatura, fiind semnul existentei unui maxim in curba ZFC. Acest maxim corespunde agentului P904. Este de notat faptul ca picul feritinei (T=9K) este atat de slab incat este clar ca nu poate fi detectat pentru zilele precedente (1, 9, 95) cand acesta este minoritar fata de semnalul provenit de la agentul P904.

La 176 zile dupa injectare, nu mai exista semnal provenind de la agentul P904 (nu mai exista maxim la 70K) si curba se apropie de cea obtinuta de la splina control, de dinainte de injectare.

Figura 9.  Curbele ZFC / FC pentru splina la diverse zile de la injectarea agentului de contrast.

Obiectiv 2.2: Studiul agentilor de contrast in soareci normali si soareci ApoE KO la diversi timpi prin microscopie bi-fotonica

Acest studiu a fost realizat in colaborare cu grupul condus de Dr. Boudewijn van der Sanden de la Institutul de Neurostiinte din Grenoble.
Pentru acest studiu, agentul P904 marcat cu fluoroforul Texas Red Cadaverine a fost injectat in soareci normali si soareci ApoE KO. La diferite intervale de timp dupa injectare (1 ora, 15 si 40 zile), au fost prelevate esantioane de aorta, ficat, splina si rinichi. Sectiuni transversale din aceste tesuturi au fost imediat observate cu ajutorul unui microscop bifotonic LSM 7 MP (Zeiss, Germania) echipat cu un obiectiv 20x imersat in apa (NA 1.0; Zeiss). Lungimea de unda de excitare a laserului infrarosu in pulsuri (Ti:Sapphire, Chameleon Ultra II; Coherent, UK) a fost de 800 nm.
Observatiile efectuate au aratat ca, la 1 ora dupa injectare si indiferent de tipul soarecelui, o parte dintre nanoparticule se afla deja in rinichi urmand a fi eliminate prin urina. La 15 zile dupa injectare (figura 10), s-a observat absenta nanoparticulelor in aorta la soarecii normali si acumularea nanoparticulelor in celulele macrofage prezente la nivelul placii de ateroscleroza in soarecii ApoE KO. Prezenta nanoparticulelor in ficat si splina a fost confirmata la toate intervalele de timp, indiferent de tipul soarecelui si este indicata in figura 10 de zonele de culoare rosie.

Figura 10. Coloanele figurii 10 reprezinta trei grupe diferite de soareci: coloana 1:  soareci control C57bl/6 neinjectati,  coloana 2:  soareci C57bl/6 injectati, cu observare la 15 zile de la administrarea agentului de contrast, coloana 3: soareci ApoE  la 15 zile dupa administrarea agentului de contrast. Liniile reprezinta diferite imagini obtinute cu microscopul bi-fotonic ale tesuturilor ex-vivo: linia 1: vederi laterale ale carjelor aortice nefixate, linia 2: tubuli nefixati din aria corticala din rinichi, linia 3: vederi laterale ale lobilor ficatilor nefixati si linia 4: zone corticale din splina. (bara de marire, 50 µm).

CONCLUZII

Microscopia bifotonica confirma distributia heterogena a aglomerarilor de nanoparticule in tesuturi observata prin microscopia electronica prin transmisie la marire mica.

Comparand rezultatele prezentate mai sus pe soareci normali cu cele obtinute pe soareci ApoE KO, se remarca faptul ca nu exista diferente in procesul de biotransformare a nanoparticulelor de oxid de fier injectate in organism. Nanoparticulele sunt internalizate de catre celulele macrofage, se aglomereaza in veziculele celulare (endozomi sau fagolizozomi) si sunt transformate lent in feritina.

Observatiile de microscopie electronica si masuratorile magnetice au aratat ca nanoparticulele de oxid de fier initiale se regasesc netransformate in veziculele celulare pana la 3 luni, timp in care invelisul lor organic este degradat. Mediul acid prezent in interiorul fagolizozomilor induce o biotransformare a structurii cristaline a nanoparticulelor, majoritatea acestora trecand de la maghemita la ferihidrita. Dupa 6 luni de la injectarea lor, nanoparticulele de oxid de fier cu structura de maghemita sunt transformate integral ceea ce conduce la formarea unui exces de feritina in organele studiate  care se regaseste atat in aglomerari in fagolizozomi, cat si libera in mediul intracelular.

Studiul prin microscopia electronica prin transmisie a mai demonstrat de asemenea ca excesul de fier datorat dozei injectate de nanoparticule nu a avut efecte toxice asupra organismului. Concluzia este suportata de imaginile de microscopie la marire mica in care se poate observa ca celule care au fagocitat nanoparticulele nu sunt necrozate. Acest lucru inseamna ca fierul este bine tolerat si prelucrat de organism chiar si atunci cand e in exces.

Deplasari in strainatate

In perioada Ianuarie – Decembrie 2013, am participat la doua scoli de microscopie electronica care au avut ca profesori invitati membri ai unor centre de microscopie electronica de prestigiu:

• 14 - 16.11.2012, 5th Summer School on Aberration Corrected STEM (Manchester, UK): Quentin Ramasse si Andrew Bleloch (SuperSTEM), Peter Nellist (University of Oxford), Ray Egerton (University of Alberta), Ondrej Krivanek (Nion).
• 13 – 24.05.2013, Quantitative Electron Microscopy 2013 (Saint-Aygulf, Franta): Angus Kirkland (University of Oxford), Paul Midgley (University of Cambridge), Sara Bals si Jo Verbeeck (EMAT), Florent Houdellier si Etienne Snoeck  (CEMES), Fabrizio Carbone (EPFL).

Pe perioada desfasurarii proiectului, am participat cu poster la doua conferinte internationale:

• 15 – 17.072012, Colloids and Nanomedicine 20012, “Follow-up of localization and biotransformations of iron oxide MRI contrast agents used for detection of atherosclerosis in a murine model”.
• 17 – 21.09.2012, Congresul European de Microscopie,  “Biolocalization and biotransformation of iron oxide core nanoparticles used as contrast agents for MRI of atherosclerosis”.

Rezultatele obtinute in timpul proiectului vor fi incluse in doua articole astfel:

• rezultatele obtinute cu colegii de la Institutul de Neurostiinte din Grenoble vor constitui un articol intitulat „Multiscale investigation of USPIO nanoparticles in atherosclerotic plaques and their catabolism and storage in vivo” ce a fost trimis spre publicare la  Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine.
• articolul „Ferritin surplus in mouse spleen 14 months after intravenous injection of iron oxide nanoparticles at clinical dose”, realizat impreuna cu colegii de la Centrul de Magnetometrie din Lyon a fost trimis la ACS Nano.