Scopul principal al proiectului este dezvoltarea unui dispozitiv bio-analitic pentru cuantificarea și detectarea de acizi nucleici (NAs). Dispozitivul este alcătuit din două elemente: i) un senzor electrochimic capabil să cuantifice și să determine concentrația de NA; și, ii) un sistem de control al temperaturii sau un microîncălzitor esențial pentru reacțiile enzimatice în timpul proceselor de amplificare a NAs. Aceste două componente vor fi echipate cu electrozi din fibre polimerice electrofilate cu acoperire metalica, atașați pe suport microfluidic pentru transportul probei. Un hidrogel va acționa ca electrolit în stare solidă necesar pentru detectarea și amplificarea NA și, în același timp, ca o barieră fizică pentru componentele sistemului de detecție. Pentru atingerea scopului principal al proiectului sunt avute în vedere următoarele obiective:
O1. fabricarea electrozilor prin atașarea fibrelor polimerice electrofilate cu acoperire metalica pe suport solid cu microcanale imprimate. Acest pas este esențial pentru fabricarea ambelor componente ale dispozitivului;
O2. fabricarea senzorului. Identificarea celor mai bune arhitecturi, combinații și/sau modificări ale electrozilor, a electrolitul în stare solidă și testarea capacității acestuia de detectare și cuantificare a NAs.
O3. fabricarea microîncălzitorului. Identificarea celei mai bune arhitecturi a electrodului, investigarea distribuției spațiale a disipării puterii și, în consecință, a capacității lor de încălzire.

Proiectul este implementat in cadrul Lab. 10 Nanostructuri functionale din INCDFM

ETAPA1. Au fost studiați parametrii procesului de electrofilare, în vederea obținerii de fibre polimerice robuste. Fibrele polimerice au fost acoperite cu Au, Ag, Pt și AgCl prin pulverizare catodică în câmp magnetron, ceea ce a permis obținerea de electrozi. Acestea au fost transferate pe patru substraturi diferite: tereftalat de polietilenă, dimetil polisiloxan, hârtie de filtru și hârtie cromatografică. Morfologia ansamblului fibre polimerice metalizate-suport a fost investigată prin microscopie electronică de baleiaj iar compoziția chimică și structurală prin spectroscopie de fotoelectroni de raze X și analiză de difracție de raze X. De asemenea, au fost obținute sisteme microfluidice pe hârtie cromatografică prin imprimare 3D din filamente de ceară și materiale polimerice cu proprietăți similare cerii. Au fost realizate teste de imprimare și de difuzie, în vedere obținerii unei bariere hidrofobe ideale, care să asigure difuzia și confinarea fluidelor într-o suprafață/volum bine determinate.

ETAPA 2. Alipirea fibrelor polimerice metalizate pe cele două parți ale sistemului microfluidic a permis obținerea de senzori electrochimici. Au fost efectuate cercetări asupra designului, geometriei și arhitecturii electrozilor pe diferite fețe ale sistemului microfluidic cu scopul obținerii unei configurații optime pentru elementul de sensing, dar și pentru a înțelege comportamentul speciilor electroactive la interfața electrod/electrolit. Au fost dezvoltate multiple arhitecturi cu grad de complexitate incremental. Testarea răspunsului electrochimic a fost realizată în arhitecturi de doi și trei electrozi. Funcționalitatea senzorilor a fost investigată electrochimic în diferite condiții de pH, compoziție a electrolitului de suport, dar și în absența și în prezența a diferite probe redox. Analiza electrochimică a fost realizată prin voltametrie ciclică și prin spectroscopie de impedanță.

În vederea dezvoltării elementului/sistemului de detecție au fost investigate diferite molecule chimice cu capacitate de interacție cu acizii nucleici. Dintre acestea, o atenție deosebită a fost oferită albastrului de metilen care are proprietatea de a interacționa cu acizii nucleici atât prin forțe electrostatice (predominante în cazul acizilor nucleici de catenă simplă) cât și prin intercalare între perechile de baze azotate (predominante în cazul acizilor nucleici de catenă dublă). A fost testată capacitatea de detecție a acizilor nucleici cu ajutorul sistemului de detecție utilizând două strategii. Prima strategie a fost bazată pe metode voltametrice utilizând albastrul de metilen ca marker electroactiv. Experimentele au demonstrat o scădere a semnalului electrochimic datorat reacțiilor redox ale albastrului de metilen odată cu creșterea concentrației de acizi nucleici, aceste variații fiind dependente de structura secundară a acestora (de catena simplă sau dublă). Au fost efectuate studii de spectroscopie Raman și reflectanță pentru a demonstra că interacția dintre acizii nucleici și albastrul de metilen are loc atât în sistemele microfluidice pe hârtie cromatografică cât și în interiorul hidrogelului de poliacrilamidă. O altă abordare a constat în utilizarea spectroscopiei de impedanță electrochimică, fără utilizarea oricărui tip de marker. Adițiile de DNA au dus la creșterea componentei imaginare a impedanței și implicit a impedanței totale a sistemului.

ETAPA 3. Au fost fabricate microîncălzitoare pe baza efectului Joule folosind plase polimerice din diverși polimeri cu acoperire de Au si Pt, iar performanța acestora de a se încălzi la trecerea curentului electric a fost investigată în funcție de densitatea de fibre. S-a observat că plasele cu transmitanțe reduse prezintă o suprafață conductivă ridicată ce contribuie la încălzirea eficientă a microîncălzitorului, dar și la efectuarea unui transfer rapid de căldură cu mediul înconjurător. Au fost testate două configurații, care au cuprins elemente cu rol în blocarea evaporării fluidului și menținerea umidității în interiorul matricei poroase a hârtiei. Astfel, prima configurație a inclus sigilarea canalului fluidic, fabricat în hârtie, între două folii de tereftalat de polietilenă (PET). A doua arhitectură a cuprins integrarea suplimentară a canalului fluidic cu un hidrogel pe una dintre suprafețele hârtiei și eliminarea unuia dintre straturile de PET. S-a observat experimental capacitatea de stimulare a curgerii fluidului dinspre hidrogel către hârtie, sub acțiunea forței capilare, demonstrând posibilitatea de menținere a volumului de fluid constant. A fost testată capacitatea dispozitivelor de a atinge valorile de temperatură identice ciclilor de amplificare PCR. Pentru început, procedura a fost efectuată în mediu uscat, în mod potențiostatic, prin aplicarea valorilor de potențial și atingerea temperaturilor corespunzătoare celor 3 etape PCR, denaturare, hibridizare și elongație. În mediu umed, pentru a asigura o putere constantă a dispozitivului sub influența volumului de fluid din matricea poroasă, procedura de termociclare a fost efectuată galvanostatic prin impunerea valorilor de curent constant ce duc la încălzirea sistemului si atingerea de temperaturi corespunzătoare celor 3 etape PCR. În final, cuantificarea produșilor de reacție ai amplificării PCR a fost realizată extern, prin proceduri electrochimice, cu ajutorul sistemului de detecție voltametric. Analiza probelor reale a fost realizată pentru detectarea și cuantificarea produșilor PCR ai genei MTHFR a cărei mutații pot duce un risc crescut de boli cardiovasculare. Au fost amplificați acizi nucleici obținuți din probe umane, iar limita de detecție a fost de 1.38 ± 0.07 ng µL^-1 HTHFR.

Indicatorii propuși pentru acest proiectau fost realizați în proporție de 100%.

ARTICLES

1. R.J.B. Leote, M. Beregoi, I. Enculescu, V.C. Diculescu, Metallized electrospun polymeric fibers for electrochemical sensors and actuators, Current Opinion in Electrochemistry, 2022, 34:101024. https://doi.org/10.1016/j.coelec.2022.101024; IF 7.664; AIS 1.411; Q1;
2. R.J.B. Leote, C.G. Sanz, V.C. Diculescu, Electrochemical characterization of shikonin and in-situ evaluation of interaction with DNA, Journal of Electroanalytical Chemistry, 2022, 921: 116663. https://doi.org/10.1016/j.jelechem.2022.116663; IF 4.598; AIS 0.568; Q1;
3. M.C. Bunea , V.C. Diculescu, M. Enculescu, D. Oprea, T.A. Enache, Influence of the Photodegradation of Azathioprine on DNA and Cells, International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23:14438. https://doi.org/10.3390/ijms232214438; IF 6.208; AIS 1.064; Q1;
4. M.-C. Bunea, T.A. Enache, V.C. Diculescu, In situ Electrochemical Evaluation of the Interaction of dsDNA with the Proteasome Inhibitor Anticancer Drug Bortezomib, Molecules 2023, 28, 3277. https://doi.org/10.3390/molecules28073277; IF 4.6.; AIS 0.660; Q2;
5. D. Botta, I. Enculescu, C. Balan, V.C. Diculescu, Integrated architectures of electrodes and flexible porous substrates for point-of-care testing, Current Opinion in Electrochemistry 2023, 42:101418. https://doi.org/10.1016/j.coelec.2023.101418; IF 8.5; AIS 1.495; Q1.
6. D. Botta, M. Beregoi, I.A. Cepleanu-Pascu, D.N. Crisan, A.-M. Ignat, E. Matei, I. Enculescu, V.C. Diculescu, A fluidic paper-based device integrated with submicronic fiber mesh electrodes for voltammetric quantification of nucleic acids, Advanced Functiona Materials, submitted;
7. D. Botta, M. Beregoi, A. Evanghelidis, I.A. Cepleanu-Pascu, E. Matei, M. Enculescu, I. Enculescu, V.C. Diculescu, Paper-based electrochemical cell integrated with electrospun fiber mesh electrodes and applications for impedimetric detection of nucleic acids, ACS Sensors, submitted.
8. D. Botta, M. Beregoi, A. Evanghelidis, I. Enculescu, V.C. Diculescu, A portable paper-based thermal cycling device for in-situ nucleic acids amplification and detection, in preparation

BOOK CHAPTERS

1. V.C. Diculescu, M.M. Barsan, T.A. Enache, Ch. 8. Biosensors for Diagnosis, in: Emerging Drug Delivery and Biomedical Engineering Technologies, ed. Dimitrios Lamprou, 1^st Edition, 2023, CRC Press, Boca Raton, USA.

1. V.C. Diculescu, New Electrode Architectures Based on Electrospun Polymeric Fibers For (Bio)Sensing Applications, at the 18th International Conference on Electroanalysis - ESEAC 2022, 5 - 9 Iunie 2022, Vilnius, Lituania. Invited talk.
2. D. Botta, Electrochemical Devices with Metallized Electrospun Fiber Meshes Electrodes, at the Biosystems in Toxicology and Pharmacology – Current challenges, online, 8-9 September 2022, Leiria, Portugal. Oral Presentation.
3. V.C. Diculescu, Electrospining for electrochemical applications, at the Biosystems in Toxicology and Pharmacology – Current challenges, online, 8-9 September 2022, Leiria, Portugal. Keynote lecture.
4. Victor Diculescu, Fibre polimerice conductoare si noi arhitecturi de electrod pentru (bio)senzoristica si actuare electrochimica, Workshop-ul „Noi frontiere și provocări ale abordărilor transdisciplinare – Analiza și Controlul Dinamicii Sistemelor Celulare” din cadrul conferinței Smart Diaspora 2023. 10-13 Aprilie 2023, Timișoara, România. Prezentare orală.
5. D. Botta, A. Evanghelidis, M. Beregoi, E. Matei, I. Enculescu, V.C. Diculescu, Microfluidic Devices with Conductive Electrospun Polymeric Fibers, 74th Annual Meeting of the International Society of Electrochemistry, 3 - 8 Septembrie 2023, Lyon, Franța. Poster.
6. V.C. Diculescu, D. Botta, M. Beregoi, A. Evanghelidis, A. Aldea, R. Branco-Leote, E. Matei, I. Enculescu, Electrospun Fibers on 3D Patterned Substrates for Point-of-Care Applications, 74th Annual Meeting of the International Society of Electrochemistry, 3 - 8 Septembrie 2023, Lyon, Franța. Prezentare orală.
7. D. Botta, V. Diculescu, M. Beregoi, A. Evanghelidis, E. Matei, I. Enculescu, An Electrochemical Paper-Based Device for Quantification of PCR-Amplified Nucleic Acids, XXVIII International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics of the Bioelectrochemical Society, 19-23 mai 2024, Alcalá de Henares, Spain. Prezentare orală.
8. D. Botta, M. Beregoi, A. Evanghelidis, E. Matei, I. Enculescu, V.C. Diculescu, Portable Electrochemical Cell on Porous Media for Nucleic Acids Detection, Les Journées d'Electrochimie, 1-5 iulie 2024, Saint-Malo, Franța. Poster.
9. D. Botta, V.C. Diculescu, M. Beregoi, A. Evanghelidis, E. Matei, I. Enculescu, Fabrication of a portable electrochemical cell based on flexible porous materials, 10th International Conference On Advanced Materials (Rocam), 15-18 iulie 2024, București, Romania. Prezentare orală.
10. .V.C. Diculescu, D. Botta, M. Beregoi, A. Evanghelidis, E. Matei, M. Enculescu, I. Enculescu, Fibras poliméricas metalizadas e substratos porosos modelados por impressão 3D para dispositivos portáveis de diagnóstico, SIBAE 2024 – XXVI Congresso da Sociedade Ibero-Americana de Electroquimica, 19-23 May 2024, Lisbon, Portugal. Prezentare Orală.
11. V.C. Diculescu, D. Botta, M. Beregoi, A. Evanghelidis, R.J.B. Leote, A. Aldea, I. Enculescu, Portable Biosensing Devices For Healthcare. 10th International Conference On Advanced Materials (Rocam), 15-18 July 2024, București, Romania. Prezentare orală.
12. V. Diculescu, D. Botta, M. Beregoi, A. Evanghelidis, E. Matei, I. Enculescu. Flexible Polymeric Meshes Assembled with 3D Patterned Porous Substrates for Point-of-Care Testing. Les Journées d'électrochimie 2024. 1-5 July 2024, Saint-Malo, France. Invited talk.
13. V.C. Diculescu, Electrospun Fibers and Paper-Based Biosensors: An Approach for Point-of-Care Diagnostics. IC-ANMBES 2024 – The 7th edition of International Conference on Analytical and Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences. 17-20 September 2024. Brasov, Romania. Invited talk.
14. V. Diculescu, D. Botta, I. Enculescu. Fluidic Electrochemical Devices On Paper With Integrated Flexible Electrodes. PRIOCHEM 2024. Simpozionul Internațional „PRIORITĂȚILE CHIMIEI PENTRU O DEZVOLTARE DURABILĂ”. 16-18 October 2024. Bucharest, Romania. Invited talk.

1. EPO. EP24207779/21.10.2024 - ELECTROCHEMICAL DEVICE WITH INTEGRATED FLEXIBLE FIBRILLARY STRUCTURE. Autori: Oana-Daciana Botta, Victor Constantin Diculescu, Ionuț Marius Enculescu, Mihaela Beregoi, Alexandru Ionuț Evanghelidis, Elena Matei
2. OSIM. A00738/25.11.2024 - DISPOZITIV PORTABIL DE TERMOCICLARE PENTRU AMPLIFICAREA ACIZILOR NUCLEICI. Autori: Oana-Daciana Botta, Mihaela Beregoi, Victor Constantin Diculescu, Ionuț Marius Enculescu, Alexandru Ionuț Evanghelidis, Mădălina Maria Ignat Bârsan.