Abstract: Recente linii de cercetare vizează utilizarea de bio-dispozitive pentru monitorizarea stresului oxidativ la nivel celular, cu accent pe utilizarea biosenzorilor pentru detectarea speciilor reactive de oxigen (ROS), cum ar fi radicalii liberi de hidroxil, superoxid și peroxid de hidrogen. Radicalul superoxid (O2•-) este specia dominanta de ROS generată de stresul oxidativ în celulă, iar enzima superoxid dismutaza (SOD) are un rol important antioxidant prin lupta împotriva efectului său toxic asupra celulelor, catalizând reacția de dismutare a O2•- la H2O2 sau O2. În acest context, prezentul proiect își propune să dezvolte noi biosenzori enzimatici de unică folosință, pe substrat de plase metalice din fibre electrospinate, pentru detecția in vivo de O2•- eliberat din culturi de celule cultivate direct pe aceeași plasă. Plasa metalică va fi fabricată din fibre polimerice electrospinate acoperite cu un strat metalic de interes. Mai mult, diferite tipuri de materiale nanostructurate, de ex. nanostructurile de metal/oxizi metalici, nanomateriale de carbon și polimeri conductori vor fi încorporate în arhitectura biosenzorului cu scopul de a îmbunătăți performanța acestuia. Plasa metalică va avea cultura celulara pe o parte si enzima SOD imobilizată pe cealaltă parte a acesteia. În acest fel, O2•- eliberat din celule prin adăugarea unui agonist va putea să difuzeze liber prin porii fibrelor și să ajungă la enzimă, unde va avea loc reacția catalizată de enzimă și va fi monitorizată prin amperometrie la potențial fix. Scopul este monitorizarea dinamica in vivo a concentrației O2•-, astfel încât să se determine concentrația critică la care apare deteriorarea celulelor provocata de acesta.

Obiectivul principal: al proiectului este dezvoltarea de noi biosenzori amperometrici de unică folosință, bazați pe enzima superoxid dismutaza (SOD) imobilizata pe fibre electrospinate metalice, pentru a monitoriza schimbarea dinamică a concentrației de superoxid (O2•−) in vivo, astfel încât să se determine o concentrație critică la care apare deteriorarea celulelor. Al doilea obiectiv vizează optimizarea biosenzorului, prin utilizarea unor fibre metalice funcționalizate cu diverse materiale nanostructurate.

Livrabile: 

1.Plase metalice pe bază de fibre electrospinate pentru dezvoltarea de biosenzori SOD și culturi celulare
2.Identificarea metodei de imobilizare adecvată a SOD pe plasa metalică.
3.Biosenzor SOD optimizat bazat pe plase metalice.
4.Fibre metalice biocompatibile.
5.Fibre metalice funcționalizate cu materiale nanostructurate
6.Biosenzor SOD optimizat bazat pe fibre metalice funcționalizate cu materiale nanostructurate
7.Fibre metalice funcționalizate biocompatibile
8.Biosenzor SOD optimizat pentru monitorizarea in vivo a O2•− în culturile celulare. Documentație pentru o cerere de brevet
9.Diagrame cu niveluri de O2•− critice care provoacă leziuni / moarte celulara.

PLAN DE REALIZARE

Etapa 1 - Fabricarea fibrelor electrospinate acoperite cu metale pentru biosenzori SOD. (O1, O2).

Act 1.1 - Electrospinarea si metalizarea fibrelor. Se vor fabrica fibre polimerice submicronice prin electrospinarea unei soluții precursoare într-un set-up experimental predeterminat. Acoperirea fibrelor de polimer obținute cu Au urmată de depunerea altor straturi metalice (continuare in anul 2021).
Act 1.2 - Imobilizarea SOD pe plase metalice obținute în A 1.1. Se vor utiliza mai multe tehnici de imobilizare, cum ar fi: adsorbția fizică, legare covalentă (care poate necesita in prealabil o funcționalizare a metalului), reticularea cu glutaraldehidă, metoda sol-gel, includerea într-o matrice polimerică etc. (continare in anul 2021).

Etapa 2 - Fabricarea fibrelor electrospinate acoperite cu Au si functionalizarea acestora cu materiale nanostructurate pentru optimizarea biosenzorilor SOD. (O2, O3, O4).

Act 2.1 -  Evaluarea biosenzorului SOD/plasă metalică optimizat pentru detecția de O2•- in vitro.
Act 2.2 - Studii de biocompatibilitate pe plasele metalice obtinute in A1.1.
Act 2.3 -  Depunerea de materiale nanostructurate pe plase metalice și caracterizarea electrochimică și morfologică a plaselor metalice funcționalizate rezultate (continare in anul 2022).
Act 2.4 -  Obtinerea biosenzorilor SOD prin imobilizarea enzimei SOD pe plase metalice funcționalizate dezvoltate în A2.3 și evaluarea biosenzorilor rezultați pentru detectia de O2•- in vitro. Rezultatele vor fi comparate cu cele obținute în A2.1, pentru a alege arhitectura optima a biosenzorului pentru aplicatii ulterioare (continare in anul 2022).

Etapa 3 - Aplicarea biosenzorilor SOD pe baza de plase metalice functionalizate pentru cuantificarea de O2•- in culturi celulare - monitorizarea efectului O2•- asupra celulelor. (O4, O5).

Act 3.1 -  Cuantificarea in vivo a O2•- in culturi celulare cu biosenzorul SOD optimizat in A1-2.
Act 3.2 - Evaluarea efectului O2•- asupra celulelor prin analiza dinamicii celulare la diferite concentratii de O2•- prin tehncici de microscopie de fluorescență.

1. Madalina Maria Barsan (U-1700-039A-2349)
   https://www.brainmap.ro/madalina-maria-barsan
   Director proiect CSI 50%
2. Teodor Adrian Enache (U-1700-031U-5399)
   https://www.brainmap.ro/teodor-adrian-enache
   Membru-Cercetator sau Inginer CSI 15%
3. Anca Aldea (U-1800-055N-8239)
   https://www.brainmap.ro/anca-aldea
   Membru-Doctorand 30%
4. Ricardo Leote (U-1900-062Y-0853)
   https://www.brainmap.ro/ricardo-leote
   Membru-Doctorand 30%
5. Caroline G Sanz (U-2100-066A-7621)
   https://www.brainmap.ro/caroline-g-sanz
   Membru-Cercetător postdoctoral 75%
6. Mariana Apostol (U-1900-062A-0316)
   https://www.brainmap.ro/mariana-apostol
   Membru-doctorand 40%
7. Oana Daciana Botta (U-1900-063Y-5281)
   https://www.brainmap.ro/oana-daciana-botta
   Membru-doctorand 35%

Diseminare - Participare la conferinte internationale

1. Disposable SOD Biosensors Based on Metallized Electrospun Polymeric Fibers for the Detection of Superoxide in Cell Culture Media (Poster)
   XXVIth International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics, Cluj-Napoca, Romania (online), 09-13 May 2021
   Caroline G. Sanz, Anca Aldea, Ricardo Leote, Madalina M. Barsan
2. Applications of Conductive Electrospun Polymeric Fibers in DNA Biosensing (Poster)
   XXVIth International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics, Cluj-Napoca, Romania (online), 09-13 May 2021
   Anca Aldea, Elena Matei, Victor C. Diculescu
3. 3D flexible electrodes for in vivo measurements in cell cultures based on conductive electrospun polymeric fibers (Invited Oral Presentation)
   XXVIth International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics, Cluj-Napoca, Romania (online), 09-13 May 2021
   Madalina M. Barsan, Caroline G. Sanz, Ariana Serban, Alexandru Evanghelidis, Victor C. Diculescu
4. Flexible Bio(sensors) for Point-of-Care Biomedical Application (Oral Presentation)
   72nd Annual ISE Meeting of the International Society of Electrochemistry, Jeju Island, Korea (online), 29 August- 3 September 2021
   Ricaro Leote, Caroline G. Sanz, Anca Aldea, Madalina M. Barsan, Victor c. Diculescu
5. Superoxide detection in cell culture media with biosensors based on electrospun fibers
   18th International Conference on Electroanalysis (ESEAC 2022)
   Caroline G Sanz, Anca Aldea, Daniel Crisan, Ricardo J.B. Leote, Melania Onea, Madalina m. Barsan
6. Bioconjufates of mercaptocarboxylic acids functionalized aunp and superoxide dismutase for superoxide monitoring (Oral Presentation)International Society of Electrochemistry ISE Regional Meeting 15-19 August, Prague, Czech Republic
   Caroline G. Sanz, Daniel N. Crișan, Ricardo J.B. Leite, Melania Onea, Madalina M. Barsan
7. New Enzymatic Biosensor Based on Metallized Electrospun Polymeric Fibers and ZnO Nanostructures for Antioxidant Properties Determination
   International Society of Electrochemistry ISE Regional Meeting 15-19 August, Prague, Czech Republic
   Anca Aldea, Caroline G. Sanz, Melania Onea, Madalina M. Barsan

Rezumatul etapei1: Fabricarea fibrelor electrofilate acoperite cu metale si imobilizarea enzimei superoxid dismutaza (SOD) pentru dezvoltarea de biosenzori electrochimici pe baza de SOD. (O1, O2). Se are in vedere fabricarea de plase metalice bazate pe fibre electrofilate polimerice submicronice prin utilizarea unei soluții precursoare corespunzătoare si unui set-up experimental predeterminat. Acoperirea fibrelor de polimer obținute cu metale sa va face prin procedee de evaporare termică (continuare in 2021). Biosenzorii se vor construi utilizând diferite metode de imobilizarea a enzimei SOD, in vederea obținerii unui biosenzor cat mai robust, e.g. adsorbția fizică, legare covalentă, reticularea cu glutaraldehidă, metoda sol-gel, includerea într-o matrice polimerică etc. (continare in anul 2021).

Rezumatul etapei2: Aceasta etapa vizează obținerea de biosenzori optimizați pentru detecție electrochimica de superoxid bazați pe imobilizarea enzimei superoxid dismutaza (SOD) pe fibre electrofilate acoperite cu metale. Optimizarea parametrilor analitici ai biosenzorului de superoxid implica atât utilizarea de diferite metode de imobilizarea a enzimei SOD (O2), cat si înglobarea de materiale nanostructurate metalice, de oxizi metalici sau de carbon in structura biosenzorului (O3). Astfel, plasele metalice obținute in WP1 vor fi modificate cu materiale nanostructurate cu scopul de a îmbunătăți performanța biosenzorului, prin faptul ca vor permite o mai bună comunicare electronică cu centrul redox al enzimei. In același scop, se va realiza si imobilizarea enzimei prin intermediul unor nanoparticule metalice, functionalizate astfel încât sa permită o legare covalenta intre enzima si nanoparticule (O2, O3). In paralel se vor efectua studii de biocompatibilitate a fibrelor nefuncționalizate si funcționalizate cu diferite materiale nanostructurate (O4).

Rezumatul etapei3: Aceasta etapa vizează aplicarea biosenzorilor SOD pe baza de plase metalice functionalizate pentru cuantificarea de superoxid O₂^•- in culturi celulare si monitorizarea efectului acestuia asupra celulelor. S-a continuat optimizarea biosenzorului de superoxid prin utilizarea de filme nanostructurate de ZnO depuse electrochimic pe plase de policaprolactona (PCl) metalizate cu aur si imobilizarea enzimei SOD prin tehnica de reticulare cu agenții EDC/NHS atât in prezenta, cat si in absenta nanoparticulelor de aur functionalizate cu acid mercaptobenzoic (AuNP_MBA). Biosenzorii obținuți vor fi evaluați într-o prima vaza in vitro, de aceasta data pentru detecția de superoxid generat in situ prin injecția de xantina in celula electrochimica ce conține dizolvata enzima xantina-oxidaza. In paralel se vor efectua studii de biocompatibilitate a fibrelor funcționalizate cu structurile de ZnO si AuNP si SOD. După investigarea biosenzorilor pentru detecția de superoxid generat in situ, aceștia for fi populați cu celule fibroblaste L929 si supuși testelor electrochimice de detecție a superoxidului generat în culturi celulare sub acțiunea unui declanșator de stres celular (O4). Mecanismul de detecție se bazează pe eliberarea proporțională de superoxid de către celule sub acțiunea declanșatorului de stres celular injectat în celula electrochimică ce integrează ca dispozitiv de detecție biosenzorul dezvoltat si optimizat. Se vor efectua măsurători de microscopie electronica de baleiaj si de fluorescenta, înainte si după acțiunea agentului stresant, pentru monitorizarea efectului superoxidului produs de acesta asupra celulelor imobilizate pe suprafața dispozitivului de detecție (O5).

1. Talanta (DOI: 10.1016/j.talanta.2022.123255):
   Disposable superoxide dismutase biosensors based on gold covered polycaprolactone fibers for the detection of superoxide in cell culture media
2. Journal of Electroanaltical Chemistry (DOI: 10.1016/j.jelechem.2021.116005)
   Quantification of cell oxygenation in 2D constructs of metallized electrospun polycaprolactone fibers encapsulating human valvular interstitial cells
3. Microchimica Acta (DOI: 10.1007/s00604-022-05352-z)
   Bioconjugates of mercaptocarboxylic acids functionalized AuNP and superoxide dismutase for superoxide electrochemical monitoring
4. Biosensors (DOI: 3390/bios12070500): PC-12 Cell Line as a Neuronal Cell Model for Biosensing Applications