Obiectivul acestui proiect multidisciplinar este de a evalua eficacitatea agentului teranostic studiat biodistribuit in mediul biologic folosind tehnicile de Microscopie Electronica prin Transmisie.

Agentul teranostic studiat continand nanoparticule de oxid de fier (maghemita - γ-Fe2O3) si oxid de ceriu se va aglomera, dupa injectarea lor in soareci, in celule de tip macrofage in interiorul fagolizozomilor. Evolutia acestor nanoparticule va fi urmarita pe o perioada lunga de timp, de pana la 120 de zile de la injectare. In timp, datorita mediului acid din fagolizozomi, nanoparticulele se vor degrada, majoritatea isi vor schimba structura cristalina. Aceasta biotransformare va fi evidentiata prin diagramele de difractie electronica si prin spectrele EELS.
Aceste rezultatele vor fi comparate cu cele obtinute intr-un mediu acid simulandu-l pe cel biologic, precum si in culturi de celule canceroase 2D si 3D.

1. Dr. Valentin-Adrian Maraloiu (https://www.brainmap.ro/valentin-adrian-maraloiu) - Director de proiect
2. Dr. Raluca Florentina Negrea (https://www.brainmap.ro/raluca-florentina-negrea)- Postdoctorand
3. Drd. Catalina Gabriela Mihalcea (https://www.brainmap.ro/catalina-mihalcea)- Doctorand
4. Drd. Cristian Radu (https://www.brainmap.ro/cristian-radu)- Doctorand

Etapa I: Caracterizarea platformei CO-ION cu dimensiune si geometrie controlate si biodegradarea ei intr-un mediu mimandu-l pe cel biologic

Pornind de la nanoparticule de Fe₃O₄ si CeO₂ cu caracteristici morfo-structurale determinate, au fost sintetizate mai multe platforme CO-ION in care a variat grosimea invelisului de CeO₂ in jurul nanoparticulelor de Fe₃O₄. O parte din aceste platforme nanocompozite au fost tratate termic. Folosind tehnicile de microscopie electronica prin transmisie (CTEM, SAED, HRTEM EDS si EELS), au fost determinate morfologia, structura cristalina si compozitia chimica a nanocompozitelor inainte si dupa tratamentul termic. S-a demonstrat ca nanocompozitele netratate termic au pastrat caracteristicile initiale ale nanoparticulelor de Fe₃O₄ si CeO₂. In cazul nanocompozitelor tratate termic, s-au constatat modificari ale caracteristicilor morfologice ale nanoparticulelor initiale de Fe₃O₄ si CeO₂: au disparut nanofirele de Fe₃O₄, iar dimensiunile nanoparticulelor de Fe₃O₄ si CeO₂ au inregistrat o usoara crestere.

Degradarea platformei CO-ION alese a fost studiata folosind un mediu acid asemanator celui din lizozomi. Experimentele de biodegradare au fost efectuate in acid citric la diferite valori ale pH la anumite perioade de timp dupa introducerea nanocompozitelor in mediul acid. Investigatiile efectuate prin tehnicile de microscopie CTEM, SAED, HRTEM EDS si EELS au demonstrat ca mediul acid nu a provocat modificari ale morfologie, structurii cristaline sau compozitiei chimice ale nanocompozitelor in  cursul a 3 saptamani.

Etapa II. Biodegradarea platformei CO-ION in vitro si in vivo

A doua etapa a proiectului s-a derulat in perioada 1 Ianuarie – 31 decembrie 2023, in cadrul a 6 activități de cercetare-dezvoltare conform Planului de Realizare. Aceasta etapa a fost dedicata determinarii modului in care are loc biodegradarea platformei CO-ION in vitro si in vivo la anumite intervale de timp dupa internalizare.

Pentru studiul biodegradarii platformei CO-ION in vitro au fost folosite culturi 2D si 3D (sferoizi) folosind liniile de celule din ficat (Huh7) si rinichi (Vero). Culturi au fost incubate cu nanoparticule initiale de Fe₃O₄ si CeO₂, precum si platforma CO-ION, la doua concentratii (25 µg/mL si 200 µg/mL) pentru 1, 2, 3 si 5 zile. Atat analizele de citotoxicitate, cat si rezultalele obtinute prin tehnicile de microscopie electronica prin transmisie au demonstrat faptul ca la concentratii mici nanoparticulele studiate nu sunt toxice, in timp ce la concentratii mari exista o usoara toxicitate. Imaginile de microscopie elelctronica prin transmisie au aratat deasemenea ca distributia nanoparticulelor in celule este heterogena, ca ele sunt localizate doar in citoplasma odata ce sunt internalizate de celule. Tehnicile de microscopie au demonstrat totodata ca nu exista schimbari ale cristalinitatii nanoparticulelor in 5 zile (pentru culturile celulare 2D) sau in 15 zile (pentru sferoizi).

Pentru studiul biodegradarii platformei CO-ION in vivo au fost folositi soareci C57BL/6 injectati intravenos in vena cozii cu solutia de nanoparticule Fe₃O₄@CeO₂ cu doza de 25 ug/mL. Esantioane prelevate ex vivo din diferite organe (ficat, rinichi, splina, creier) la diferite intervale de timp (1, 7, 15, 30, 60, 90 si 120 zile) dupa injectare au fost preparate prin fixare, postfixare, deshidratare si inglobare in rasina, sectiuni de 100 nm grosime din blocurile de rasina obtinute fiind apoi taiate folosind ultramicrotomul Leica UC7.

Imaginile de microscopie electronica prin transmisie au aratat ca distributia nanoparticulelor in celule este heterogena, ca ele sunt localizate doar in citoplasma odata ce sunt internalizate de celule. Pe de o parte, se observa ca in timp aglomerarile de nanoparticule CO-ION devin mai mici in dimensiune si totodata mai dispersate. Pe de alta parte se observa aglomerari de feritina care poate fi intrinseca (ca urmare a proceselor metabolice normale), fie extrinseca (ca urmare a biotransformarii nanoparticulelor de Fe₃O₄ in feritina). Totodata, in imaginile CTEM nu se remarca semne de toxicitate indusa de prezenta nanoparticulelor de CO-ION in tesuturi.

Etapa III. Diseminarea rezultatelor

In afara de articolulpublicat in 2023, mai sunt in lucru alte trei manuscrise:

1. “Fe₃O₄/CeO₂ Nanoplatform with “Core/Shell”-Like Structure: biodegradation and biotransformation in mimicking intracellular environment”; autori: Valentin-Adrian Maraloiu, Catalina Mihalcea, Cristian Radu, Yuliia Shlapa, Anatolii Belous;
2. “Cytotoxicity and biodistribution of Fe₃O₄/CeO₂ Nanoplatform with “Core/Shell”-Like Structure in 2D / 3D healthy cell cultures”; autori: Valentin-Adrian Maraloiu, Catalina Mihalcea, Cristian Radu, Aida Selaru, Sorina Dinescu, Yuliia Shlapa, Anatolii Belous;
3. “Biodegradation and biotransformation of Fe₃O₄/CeO₂ Nanoplatform with “Core/Shell”-Like Structure in murine model”; autori: Valentin-Adrian Maraloiu, Catalina Mihalcea, Cristian Radu, Cosmin Mustaciosu, Yuliia Shlapa, Anatolii Belous.

Rezultatele etapei II  vor fi prezentate intr-un poster la a 9-a editie a International Workshop of Materials Physics ce va avea loc intre 14 - 16 Mai 2024 in Magurele, Romania. Prezentarea va fi intitulata „Cytotoxicity and biotransformation of Cerium Oxide-Iron Oxide platform in cells cultures and murine model”.

Articole publicate:

1. Shlapa, Y; Siposova, K; Veltruska, K; Maraloiu, VA; Garcarova, I; Rajnak, M; Musatov, A; Belous, A - Design of Magnetic Fe₃O₄/CeO₂ "Core/Shell"-Like Nanocomposites with Pronounced Antiamyloidogenic and Antioxidant Bioactivity; ACS APPLIED MATERIALS & INTERFACES; 15 (42); 49346-49361; DOI: 10.1021/acsami.3c10845 

Participari la conferinte:

1.  Prezentare orala: "Biodistribution, biodegradation and cytotoxicity of Cerium Oxide-Iron Oxide platform in healthy cells",

Autori: Valentin-Adrian MARALOIU, Yuliia Shlapa, Anatolii Belous, Aida Selaru, Sorina Dinescu

A 5-a editie a Conferintei Societatii de Microscopie Electronica din Romania, 18-27 Octombrie 2023, Cluj-Napoca, Romania

2. Prezentare poster: "Cytotoxicity and biotransformation of Cerium Oxide-Iron Oxide platform in cells cultures and murine model"

Autori: Valentin-Adrian Maraloiu, Catalina Mihalcea, Cristian Radu, Yuliia Shlapa, Anatolii Belous, Aida Selaru, Sorina Dinescu, Cosmin Mustaciosu

A 9-a editie a International Workshop of Materials Physics, 14-16 Mai 2024, Magurele, Romania